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 微生物扩增子测序技术解决方案

1、概况

微生物扩增子测序是基于二代测序平台,利用双末端测序(Paired-End)的方法, 构建小片段文库进行测序。通过对 Reads 拼接过滤,OTUsOperational Taxonomic Units)聚类,并进行物种注释及丰度分析,可以揭示样品的物种构成; 进一步进行α多样性分析(Alpha Diversity)、β多样性分析(Beta Diversity)和显著物种差异分析等等,可以挖掘样品之间的差异。

目前,微生物多样性研究主要是于编码核糖体RNA的核酸序列保守区进行的。细菌主要是基于16S区,真菌主要基于18S区或ITS区(内转录间区),16S rDNA 是编码原核生物核糖体小亚基rRNA16S rRNA)的DNA序列,18S rDNA是编码真核生物核糖体小亚基rRNA18S rRNA)的DNA序列,ITS是编码真核生物核糖体小亚基rRNADNA内转录间隔区序列。这些序列中既有保守区又有可变区,保守序列区域反映了生物物种间的亲缘关系,而高变序列区域则能体现物种间的差异。

 

2、实验技术路线

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3、生物信息学分析内容

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4、测序须知

1)送样要求

Ø 土壤:10g

Ø 粪便:3-5g

Ø 血液:10ml

Ø 污泥:5-10g

Ø DNA总量 ≥2μg、浓度≥ 20 ng/μL1.8 < OD260/280 < 2.0

2)平台选择

Ø Illumina PE250/300

3)推荐测序量

Ø 土壤:3-4

Ø 粪便:3-4

Ø 肠粘膜:2-3

Ø 胃液:2-3

Ø 水样:>1

Ø 沉积物:>1

Ø 皮肤表面:1-2

 

 

5、优势与问题

1)优势

Ø 微生物无需进行分离、培养,通过对样本中所有微生物遗传物质DNA进行测序,可以获知微生物的分类地位,解决了环境中大部分微生物不能分离培养的局限性问题。

Ø 无宿主干扰,通过PCR扩增16S/18S/ITS的目标区域片段,可以有效宿主污染问题。

Ø 操作简单、价格便宜,相比于宏基因组shotgun测序,扩增子测序从测序到分析相对简单,价格也便宜。

2)问题

Ø 受引物影响,有引物偏性

Ø 大部分情况下不能鉴定到种级别

Ø 不同微生物环境所需引物不同

6、应用方向及解决的关键问题

1)医学领域

微生物组学在医学领域主要应用在人类微生态领域,研究和人体共生的微生物群落,探讨微生物群落和疾病及健康之间的联系。

2)农业领域

微生物组学技术已广泛应用于各种环境体系的微生物研究中。研究热点主要包括1)自然环境微生态,如作物根系或受污染等土壤微生物,海洋、污水等水体微生物;2)工业环境微生态,如食品发酵液、工业废水、污泥处理器等微生物多样性,以及产甲烷菌、硝化/反硝化细菌的功能基因研究。此外,在食品或药品的微生物安全检测中也有所应用。

 

7、主要结果展示

1Alpha多样性分析

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1OTUs shannon指数稀疏曲线

备注:当OTU的稀疏曲线趋于平缓时,就可以认为测序深度已基本覆盖样品中的所以物种了,shannon指数主要反映群落种数和各种间个体分配的均匀性。

 

2)物种组成分析

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2、多样品OTUs HeatmapVenn图及花瓣图

Ø Heatmap图中每一列代表一个样品,每一行代表一个OTU,颜色深浅代表该OTU所包含的reads数目,红色表示高,蓝色表示低,见左图。

 

Ø Venn图是统计每组样品中独有的OTU与所有组中共同拥有的OTU数目作图,见右上图。

 

Ø 花瓣图是统计多组样品中独有的OTU与所有组中共同拥有的OTU数目作图,见右下图


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3、群落微生物物种组成柱状图(Genus level

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4多样品分类学比较树状图

根据多个样本的分类学比对结果,选出优势物种(丰度前N或所占百分比大于指定P)的分类,画出其所在的分类学谱系树状结构图。

 

 

3)物种与样本关系图

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5物种与样本关系图

样本与物种的共现性关系图是一种描述样本与物种之间对应关系的可视化圈图,该图不仅反映了每个样本的优势物种组成比例,同时也反映了各优势物种在不同样本之间的分布比例。

 

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6
 Anosim 组间差异分析和PCoA分析

4)样本比较分析

Ø Anosim 组间差异分析,纵坐标为样本间距离的秩,横坐标:Between为两组之间的结果,其他两个为各自组内的结果,见上图左。

Ø PCoA分析:主坐标分析(PCoAPrincipal Co-ordinates Analysis),是通过一系列的特征值和特征向量排序从多维数据中提取出最主要的元素和结构。

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7、相似性聚类分析

 

5)物种差异分析

 

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8组间差异物种分析LDA

备注:LDALinear Discriminant Analysis组间差异显著物种又可以称作生物标记物(biomarkers),该分析主要是想找到组间在丰度上有显著差异的物种。图中不同颜色代表不同样本或组之间的显著差异物种。

6)关联分析

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9CCA分析

备注:CCACanonical Correspondence Analusis,主要是分析环境因子与样品聚类之间的关系,找出哪些因子对三种水体中的物种组成会有比较明显的影响。

 

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10、相关性heatmap

说明:XY轴上均为物种。通过计算获得R值(秩相关)和校正错误发现率的P值。R值在左下图中直接以数字展示和右上图中以圆圈的大小和颜色表示,圆圈越大R值越大,蓝色正相关,红色负相关。P值在右上方图中通过“*”标出,“*”,“**”,“***”分别代表0.05,0.010.001水平。右侧图例是不同R值的颜色区间。

 

 

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11、相关性网络分析

说明:每个点代表一个物种,点的大小代表物种的相对丰度,同一种颜色代表同一个属,物种之间的连线,红色代表正相关,蓝色代表负相关,线的粗细代表相关性的大小。

7)进化分析

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12、进化分析

说明:属水平物种的代表序列构建的系统发育树,分支和扇形的颜色表示其对应的门,扇环外侧的堆积柱形图表示该菌属在不同样本中的丰度分布信息。

 

8)功能预测分析

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13差异比较的误差线图

左图所示为不同功能丰度在两个样品 () 中的丰度比例,中间所示为95%置信度区间内,功能丰度丰度的差异比例,最右边的值为p 值,p 值<0.05,表示差异显著,功能丰度用红色标识。

 

8、案例分析

Diet-induced remission in chronic enteropathy is associated with altered microbial community structure and synthesis of secondary bile acidsMicrobiome2019

实验设计

本研究中,基于基因测序对患有慢性肠炎的狗进行检测,探究在给与治疗性水解蛋白饮食治疗后,粪便微生物群落结构和代谢产物的变化。比较DR组与NDE组,随时间的变化水解蛋白饮食对肠道微生物群落结构和功能的重塑

实验结果

1)与治疗结果相关的微生物群落结构的鉴定

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14 饮食治疗中与治疗结果相关的微生物群落学鉴定

 

2)饮食治疗后缓解期特定微生物群的变化

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15 治疗性饮食改善与慢性肠病相关的失调,并诱导与缓解相关的微生物群变化

 

3Chiranonis是一种对饮食有反应的物种,能够产生次级胆汁酸

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16 C.hiranonis是一种有益的微生物,具有改善肠道疾病的能力

The upper-airway microbiota and loss of asthma control among asthmatic children

实验设计

本研究将微生物组研究和加强黄区时期吸入型糖皮质激素以防止哮喘恶化的临床试验结合起来。首先研究者对2545~11岁学龄哮喘儿童进行人口统计学和临床特征的统计,对其中参与临床试验的214名儿童分别在随机分组时期和黄区时期采集了鼻腔样本;接着对这些样本进行总基因组的提取,从而进行16S rRNA基因测序及分析,根据测序结果,研究者使用相对丰度不低于0.1%的分类菌属来构建随机分组时期和黄区时期的热图;同时,研究者还利用qPCR对样本中的总细菌数进行了定量;最后,研究者通过层次聚类和完全连锁分析法鉴定16S rRNA基因序列,从而对微生物组数据进行统计分析。

 

实验结果

1)随机分组时期呼吸道微生物群的特征

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17.随机分组时鉴定的前25种主要分类群

条形图显示了不同年龄组中前25个最丰富的分类群(a)和样本中存在的呼吸道病毒(b)。以95%置信区间来展示发展中YZ的比值(c)。原始数据通过源文件提供。

2)基线时的微生物群和未来的哮喘失控 

 

18.随机分组时鼻样本中鉴定到的细菌簇(n=214

通过层次聚类和完全连锁分析法鉴定到Corynebacterium + Dolosigranulum(蓝绿色),Staphylococcus(黑色),Streptococcus(粉红色)和Moraxella(蓝色)。相对丰度大于0.1%的细菌菌属用于聚类分析。对每个细菌簇进行了年龄分组、样品中出现呼吸道病毒和黄区发作年变化率的标注。

19.随机分组时呼吸道细菌簇的黄区(YZ)年率

a.与其它3个簇的组合相比,Corynebacterium +Dolosigranulum簇的YZ年率。箱形图中间的线代表YZ年率的中值;箱形图底部和顶部的线分别代表数据值的25%75%。垂直线上方的点代表数据中的异常值。b.四种呼吸道细菌簇的YZ年率。在图ab中,每个点代表簇中的每一个参与者。使用秩和检验来检测两个簇之间YZ年率的统计学差异。

3)从随机分组时期到YZ时期呼吸道微生物群的变化 

20.随机分组时期(RD)和黄区时期(YZ)之间细菌微生物组的比较

a.使用成对的随机分组时期(n=102)和黄区(n=102)数据鉴定出5个细菌簇。每个条形图代表了属于给定细菌簇的患者比例。RD采集的样本为绿色,YZ采集的样本为橙色。绿色/橙色条形的比例总和等于100%。使用Chiseq-test确定5个簇中患者分布的统计学差异。b.每个研究参与者在RDYZ过程中细菌微生物组的相对丰度变化。图中标绘了每一个受试者在RD(上图)到YZ(下图)过程中前25种细菌的相对丰度变化。样品按照RD的细菌簇排列,从左到右依次为(1Corynebacterium +Dolosigranulum2Haemophilus3Moraxella4Staphylococcus5Streptococcusc. RDYZ样本中的总细菌数。通过qPCR估算总细菌数为每微升16S rRNA百万个拷贝。d. RDYZ的细菌丰富度。使用秩和检验检测总细菌数和细菌丰富度的统计学差异。

21.从随机分组时期到黄区时期细菌簇的变化

RD(左边)和YZ(右边)中每个细菌簇中的数字是每个特定簇转变的患者数目。

 4YZ时期和哮喘发作时的呼吸道菌群

22.黄区时期(YZ)的105个鼻样本中鉴定的细菌簇

通过层次聚类和完全连锁分析法鉴定到Corynebacterium + Dolosigranulum(蓝绿色),Staphylococcus(黑色),Streptococcus(粉红色)和Moraxella(蓝色)。相对丰度大于0.1%的细菌菌属用于聚类分析。

5YZ时期的呼吸道病毒和哮喘加剧

23. YZ中五个细菌簇内呼吸道病毒呈阳性或阴性的受试者比例

病毒阳性(红色,n=78)和病毒阴性(蓝色,n=27)的样本数量不成比例的分布在不同的细菌簇中。属于Moraxella簇或Haemophilus簇的受试者都呈现病毒阳性反应。

9、参考文献

[1] Shuai Wang 1, Rene Martins 2, Megan C. Sullivan, et al. Diet-induced remission in chronic enteropathy is associated with altered microbial community structure and synthesis of secondary bile acids. Microbiome, 2019, 10.1186/s40168-019-0740-4

[2] Yanjiao Zhou, Daniel Jackson, Leonard B. Bacharier, et al. The upper-airway microbiota and loss of asthma control among asthmatic children. Nature Communications, 2019, 10:5714 |https://doi.org/10.1038/s41467-019-13698-x|www.nature.com/naturecommunications

 

 

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