单细胞转录组分析技术链条式解决方案
样品要求
1) 起始材料:单个细胞(由客户自己分离)
2) 单细胞裂解液:1x Triton X-100
3) 单细胞放大试剂盒:可选择购买单细胞放大试剂盒
4) 单细胞RNA放大后质检标准:
a) 样品浓度:最低浓度不低于0.2 ng/µL。
b) 样品总量:每个样品总量不少于5 ng。
c) 样品长度分布:长度不小于600 bp。
d) 样品运输:用冻存管保存,并用干冰或液氮运输。
实验流程

注:实验相关试剂盒
1)cDNA合成试剂盒:
• SMARTer® Ultra™ Low Input RNA Kit - v3 (Clontech)
• TransPlex Whole Transcriptome Amplification (WTA) Kit (sigma)
2)DNA样本准备试剂盒:
• Nextera DNA Sample Preparation Kit (Illumina, catalogue # FC-121-1031)
• Nextera XT DNA Sample Preparation Kit (Illumina, catalogue # FC-131-1024)
• NEBNext® DNA Library Prep Master Mix Set (New England BioLabs)
3)定量试剂盒:
• High Sensitivity DNA analysis kit(Agilent Bioanalyzer)
• KAPA Library Quantification Kit(Kapa Biosystems)
生物信息学分析
单细胞转录组的生物信息分析产品介绍见表1。

后续实验方案
1) 定量PCR验证
定量PCR技术是指以外参或内参为标准,通过对PCR终产物的分析或PCR过程的监测,进行PCR起始模板量的定量。对于单细胞转录组分析得到的表达基因,差异表达基因,
或是时序特征的表达基因,可以使用定量PCR检测表达量,从传统实验角度,对单细胞转录组测序的分析结果进行验证。
2) 基因芯片验证
基因芯片又称为DNA微阵列(DNA microarray),是指利用固定在支持物上的探针分子与样品分子进行杂交,通过检测每个探针分子的杂交信号,进而获得样品分子的相对表
达水平,也是属于高通量的检测技术。对于单细胞转录组分析得到的基因表达情况,可以使用基因芯片的技术,批量的对表达基因检测,进行基因表达量水平的验证。
研究案例结果展示
1. 人胚胎和小鼠胚胎发育过程研究[1]
单细胞测序样品:分别对人和小鼠的胚胎发育期的,卵母细胞,原核,卵细胞,2-cell阶段,4-cell阶段,8-cell阶段和桑葚胚时期的细胞进行单细胞转录组测序。
分析结果:
1) 对人和小鼠的胚胎发育过程的各时期进行单细胞转录组测序分析,为胚胎植入前的诊断方法提供了新的方法。
2) 结合外显子测序分析,对胚胎发育时期的单核苷酸变异(single nucleotide variants, SNV) 进行了研究,确定了胚胎发育过程中具有时期特异性的单等位基因表达模式。
3) 通过基因共表达网络分析,发现了胚胎发育各时期具有特异性的共表达基因的功能模块,也从转录谱的基因功能推测胚胎发育过程的功能基因表达时序性。
4) 人和小鼠的胚胎发育过程对比研究发现,有7个网络模块在胚胎发育过程中具有保守性和时期特异性。

图1 样品聚类和差异基因聚类分析

图2 胚胎发育时期的SNV分析

图3 胚胎发育过程的特征模块分析

图4 特征模块的保守性分析
2. 胚胎发育过程和胚胎干细胞的单细胞转录组测序研究[2]
单细胞测序样品:分别对人和小鼠的胚胎发育期的,卵母细胞,卵细胞,2-cell阶段,4-cell阶段,8-cell阶段,桑葚胚期和囊胚时期的细胞进行单细胞转录组测序。
分析结果:
1) 通过对胚胎发育时期的124个细胞进行转录组测序,构建了完整了人类胚胎发育时期的转录谱,检测了22687个母源表达基因,其中包括8701个长链非编码
RNAs(long noncoding RNAs, lncRNAs),相比于以往的基因芯片技术检测的9735个基因,数目大大增加。
2) 在胚胎发育时期,检测了2733个全新lncRNAs, 并有可能与胚胎发育过程密切相关。
3) 成功分离出囊胚期的上胚层细胞,原始内胚层细胞和滋养层细胞,并对上胚层细胞的表达谱与胚胎干细胞进行了对比分析,发现1498个基因
在囊胚时期和胚胎干细胞中具有表达量差异。

图5 样品聚类和基因表达模式聚类图

图6 可变剪接分析

图7 胚胎发育过程中的lncRNA表达研究

图8 新转录本和新lncRNAs分析
参考文献
[1] Zhigang Xue, Kevin Huang, Chaochao Cai, et al. Genetic programs in human and mouse early embryos revealed by single-cell RNA sequencing. Nature, 2013, 500(7464): 593-7.
[2] Liying Yan, Mingyu Yang, Hongshan Guo, et al. Single-cell RNA-Seq profiling of human preimplantation embryos and embryonic stem cells. Nat Struct Mol Biol, 2013, 20(9): 1131-9.
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