单细胞转录组分析技术链条式解决方案

样品要求

1） 起始材料：单个细胞（由客户自己分离）

2） 单细胞裂解液：1x Triton X-100

3） 单细胞放大试剂盒：可选择购买单细胞放大试剂盒

4） 单细胞RNA放大后质检标准：

a)       样品浓度：最低浓度不低于0.2 ng/µL。

b)       样品总量：每个样品总量不少于5 ng。

c)       样品长度分布：长度不小于600 bp。

d)       样品运输：用冻存管保存，并用干冰或液氮运输。

实验流程

注：实验相关试剂盒

1）cDNA合成试剂盒：

•         SMARTer^® Ultra™ Low Input RNA Kit - v3 (Clontech)

•         TransPlex Whole Transcriptome Amplification (WTA) Kit (sigma)

2）DNA样本准备试剂盒：

•         Nextera DNA Sample Preparation Kit (Illumina, catalogue # FC-121-1031)

•         Nextera XT DNA Sample Preparation Kit (Illumina, catalogue # FC-131-1024)

•         NEBNext^® DNA Library Prep Master Mix Set (New England BioLabs)

3）定量试剂盒：

•         High Sensitivity DNA analysis kit(Agilent Bioanalyzer) 

•         KAPA Library Quantification Kit(Kapa Biosystems)

生物信息学分析

单细胞转录组的生物信息分析产品介绍见表1。

后续实验方案

1） 定量PCR验证

定量PCR技术是指以外参或内参为标准，通过对PCR终产物的分析或PCR过程的监测，进行PCR起始模板量的定量。对于单细胞转录组分析得到的表达基因，差异表达基因，

或是时序特征的表达基因，可以使用定量PCR检测表达量，从传统实验角度，对单细胞转录组测序的分析结果进行验证。

2） 基因芯片验证

基因芯片又称为DNA微阵列（DNA microarray），是指利用固定在支持物上的探针分子与样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号，进而获得样品分子的相对表

达水平，也是属于高通量的检测技术。对于单细胞转录组分析得到的基因表达情况，可以使用基因芯片的技术，批量的对表达基因检测，进行基因表达量水平的验证。

研究案例结果展示

1.      人胚胎和小鼠胚胎发育过程研究^[1]

单细胞测序样品：分别对人和小鼠的胚胎发育期的，卵母细胞，原核，卵细胞，2-cell阶段，4-cell阶段，8-cell阶段和桑葚胚时期的细胞进行单细胞转录组测序。

分析结果：

1） 对人和小鼠的胚胎发育过程的各时期进行单细胞转录组测序分析，为胚胎植入前的诊断方法提供了新的方法。

2） 结合外显子测序分析，对胚胎发育时期的单核苷酸变异(single nucleotide variants, SNV) 进行了研究，确定了胚胎发育过程中具有时期特异性的单等位基因表达模式。

3） 通过基因共表达网络分析，发现了胚胎发育各时期具有特异性的共表达基因的功能模块，也从转录谱的基因功能推测胚胎发育过程的功能基因表达时序性。 

4） 人和小鼠的胚胎发育过程对比研究发现，有7个网络模块在胚胎发育过程中具有保守性和时期特异性。

          图1 样品聚类和差异基因聚类分析

                               图2 胚胎发育时期的SNV分析

                图3 胚胎发育过程的特征模块分析

                       图4 特征模块的保守性分析

2.      胚胎发育过程和胚胎干细胞的单细胞转录组测序研究^[2]

单细胞测序样品：分别对人和小鼠的胚胎发育期的，卵母细胞，卵细胞，2-cell阶段，4-cell阶段，8-cell阶段，桑葚胚期和囊胚时期的细胞进行单细胞转录组测序。

分析结果：

1)       通过对胚胎发育时期的124个细胞进行转录组测序，构建了完整了人类胚胎发育时期的转录谱，检测了22687个母源表达基因，其中包括8701个长链非编码

RNAs（long noncoding RNAs, lncRNAs），相比于以往的基因芯片技术检测的9735个基因，数目大大增加。

2)       在胚胎发育时期，检测了2733个全新lncRNAs, 并有可能与胚胎发育过程密切相关。

3)       成功分离出囊胚期的上胚层细胞，原始内胚层细胞和滋养层细胞，并对上胚层细胞的表达谱与胚胎干细胞进行了对比分析，发现1498个基因

在囊胚时期和胚胎干细胞中具有表达量差异。 

                图5 样品聚类和基因表达模式聚类图

              图6 可变剪接分析

                  图7 胚胎发育过程中的lncRNA表达研究

                 图8 新转录本和新lncRNAs分析

参考文献

[1]      Zhigang Xue, Kevin Huang, Chaochao Cai, et al. Genetic programs in human and mouse early embryos revealed by single-cell RNA sequencing. Nature, 2013, 500(7464): 593-7. 

[2]      Liying Yan, Mingyu Yang, Hongshan Guo, et al. Single-cell RNA-Seq profiling of human preimplantation embryos and embryonic stem cells. Nat Struct Mol Biol, 2013, 20(9): 1131-9.