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microRNA测序技术链条式解决方案

研究路线

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1 microRNA测序研究路线图

样品要求

1)      样品类型:细胞、新鲜组织或RNA样品。

2)      样品量:细胞样品请提供至少107个细胞;组织样品请提供至少50 mg的组织块或切片;RNA样品请提供6 μg以上的总RNA。最少提供一个样品进行测序。

3)      样品纯度:RNA无明显降解,提取的总RNA OD260/OD280值在1.82.2之间,浓度 ≥ 100 ng/μL28S : 18S ≥ 1.5RNA完整性RIN ≥ 8DNA应该去除干净。

4)      样品浓度:最低浓度不低于100 ng/µL

5)      保存运输:

²  细胞样品或新鲜组织块(切成~50 mg的小块)可用TRIZOLRNA保护剂处理或液氮冻存后,-80保存;

²  RNA样品可溶于乙醇或RNA-free的超纯水中,-80保存;

²  样品保存期间避免反复冻融。样品置于1.5 ml管中,封口膜封好,干冰运输。

生物信息学分析

microRNA测序数据主要分析内容包括已知microRNA鉴定,新microRNA预测、靶基因预测、差异基因筛选等。

microRNA测序的生物信息分析产品介绍见下表:

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实验验证 

RT-qPCR定量技术是经文献证实的最有效的microRNA定量分析技术,实验过程包括RNA提取、反转录、荧光定量PCR。由于成熟的microRNA长度较短(~ 22 nt),rt-primer的设计比较困难(我处提供引物设计服务)。目前,比较常用的技术是Taqman miRNA AssayLife TechnologiesmiRCURY LNA Universal RT microRNA PCR assayExiqon。前者为stem-loop RT -qPCR,后者为poly(A) RT-qPCR

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2 RT-qPCR示意图

microRNA模拟物和阻遏物

随着成百上千的microRNA在植物、动物和病毒中被鉴定出来后,通过抑制细胞中microRNA的表达水平来研究microRNA的功能迅速发展为一个重要的研究领域。通过导入化学合成的小分子microRNA模拟物(mimics)或拮抗microRNA的阻抑物(antagomir),观察靶mRNA及编码蛋白表达以及细胞、动物水平的表型变化,进行信号通路研究,是目前microRNA功能研究的常用方法。

降解组测序

降解组测序的应用,主要在确认上游microRNA的剪切基因,进而得知下游影响基因路径。可由microRNA微数组芯片或利用下一代测序发掘新的microRNA,来获得microRNA表现量差异,从降解组测序确认microRNA剪切哪些基因,再由下游使用全基因芯片进一步检测影响基因表现量差异,结合生物信息 Gene Ontology (GO)Pathway 分析与外表性状,将植物microRNA的调控,由上而下整体性了解分析,降解组测序适时的扮演目前在microRNA研究中对于确认剪切基因的关键性角色。降解组测序可广泛应用于靶基因功能的研究、生物性状的调控研究、致病机理研究及药物的开发等多领域。

萤光素酶报告系统  

  在确定了靶mRNA之后,找到位于3ˊ-UTR区的microRNA结合位点是研究者下一步关心的内容。通过生物信息学分析获得候选的microRNA结合区域,将野生型和结合位点突变的3ˊ-UTR序列克隆入商品化的萤光素酶报告载体(例如pMIR-REPORT miRNA Expression Reporter Vector系统),通过观察microRNA对发光强度的影响对结合位点加以验证。

数据分析结果展示

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预处理之后reads的长度分布统计图                                           各类RNA注释统计图

 

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5 microRNA二级结构示意图

 

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比对到基因组可视化图

 

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7 miRNA第一个碱基和所有碱基的偏好性图

 

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样品密度分布图和共表达聚类图

 

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在物种中microRNA家族的分布情况

 

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10 microRNA家族比较的气泡图

 

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11 microRNA cluster在基因组位置上的分布示意图

 

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12 样品之间miRNA的差异表达图                     13 miRNA靶基因数目统计图

                                                                                                                  (红点表示表达差异的microRNA

 

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14 microRNA与靶基因通路注释

 

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15 靶基因通路柱状图

 

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16 microRNA与靶基因网络互作及microRNA与靶基因、疾病关联图

 

参考文献

1.    Wotschofsky Z, Liep J, Meyer HA, et al. Identification of Metastamirs as metastasis-associated microRNAs in clear cell renal cell carcinomas. International Journal of Biological Sciences, 2012, 8(10): 1363-1374.

2.    Wang J, Czech B, Crunk A, et al. Deep small RNA sequencing from the nematode Ascaris reveals conservation, functional diversification, and novel developmental profiles. Genome research, 201121(9): 1462-1477.

3.    The [networks, functional analyses, etc.] were generated through the use of IPA (Ingenuity®Systems, www.ingenuity.com). 

4.    Valérie Metzinger-Le Meuth, Eléonore M'Baya-Moutoula, Fatiha Taibi, et al. Implication of microRNAs in the pathophysiology of cardiac and vascular smooth Muscle Cells. In: Haruo Sugi eds. Current Basic and Pathological Approaches to the Function of Muscle Cells and Tissue - From Molecules to Humans. Intech, 2012.

 

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