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  有参考基因组的转录组分析技术链条式解决方案

样品要求

1)  样品总量:真核生物6 μg,原核生物20 μg

2)  样品浓度:真核生物100 ng/μL,原核生物65 ng/μL

3)  样品纯度:OD260/ OD280 1.828S/18S1

4)  RNA完整性:植物、真菌RIN6.5,动物RIN7.0,原核生物RIN6.0

测序平台

目前转录组测序的二代测序平台主要有Illumina公司的GA IIHiseqMiseq以及Roche 454等。比较常用的是Illumina

Hiseq 2000Hiseq 2500Miseq其中,Miseq适合快速低深度测序;Hiseq 2000适合高通量测序,但测序周期偏长;

Hiseq 2500则可以对高通量测序和快速测序模式进行选择,建议客户

根据不同的实验需求进行选择。

生物信息学分析

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后续实验方案

1) 定量PCR验证

定量PCR技术是指以外参或内参为标准,通过对PCR终产物的分析或PCR过程的监测,进行PCR起始模板量的定量。

对于RNA-seq得到的差异表达基因,可以通过定量PCR技术,

从传统实验角度,对分析结果进行验证,来说明基因差异表达的生物学现象。

2) 基因芯片验证

基因芯片又称为DNA微阵列(DNA microarray),是指利用固定在支持物上的探针分子与样品分子进行杂交,通过检测每个

探针分子的杂交信号,进而获得样品分子的相对表达水平,也是属于高通量的检测技术。对于RNA-seq得到的差异表达基因,

可以使用基因芯片的技术,批量的对差异表达基因检测,进行表达量水平差异的验证。

3) 基因过表达研究

通过RNA-seq测序技术和生物信息学的数据分析,能够得到不同条件下,表达量差异的基因。在通过基因功能分析之后,

挑选出潜在的与不同环境,不同品种或是不同生物学调控过程的高相关性基因,再通过对特定细胞系的培养,通过对该

基因的表达量进行过量表达,来验证基因与表型间的相关性。

4) siRNA knockdown

对于关键基因与表型间的相关性研究,除了过表达之外,还可能使用knockdown的实验方法,使用RNA干扰技术,来证明

基因与表型的相关性。

分析结果展示

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                               1 reads比对到参考基因组的比率统计

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                   图转录组表达谱的表达量分布

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                   图生物学重复样本表达量的散点图

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                        图基因检测区间统计

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                 图组间表达情况韦恩图

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               图差异表达基因(左为MA图分布,右为火山图分布)

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              图差异表达基因聚类图

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                 图差异表达基因GO词条分布图

 

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               图新转录本分布统计

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              图10  变异位点分布位置统计

参考文献

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gene fusions. Genome Biology, 2013, 14(4): R36.

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