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  基于靶向测序的宏基因组学技术链条式解决方案

样品要求

1)  生物质样品:4℃低温保存,并尽快进行DNA提取或安排送样,以防样品中微生物组成发生变化。

2)  DNA样品:样品量≥500 ng,样品浓度≥10 ng/μL,样品纯度OD260/OD280 = 1.8~2.0;样品切忌反复冻融,送样时请使用冰袋或干冰。

3)  PCR样品:样品量≥100 ng,样品浓度≥5 ng/μL,样品纯度OD260/OD280 = 1.8~2.0;样品切忌反复冻融,送样时请使用冰袋或干冰。

116s rDNA可变区的选择 [1, 2]

²   V1 best differentiated among Staphylococcus aureus and coagulase negative Staphylococcus sp.;

²   V2 and V3 were most suitable for distinguishing all bacterial species to the genus level except for closely related Enterobacteriaceae. V2 best distinguished among Mycobacterium species and V3 among Haemophilus species;

²   V6 could distinguish among most bacterial species except Enterobacteriaceae;

²   V4, V5, V7 and V8 were less useful targets for genus or species-specific probes.

2:引物设计 [3, 4]

针对16s rDNA各个可变区已有比较成熟的通用引物,引物信息可到ProbeBasehttp://www.microbial-ecology.net/ probebase/default.asp?mode=search)查找。引物选择时需要区分种属特异性引物与通用引物,根据不同的试验目的,选择合适的引物(可咨询我处)。

测序平台

现在,适合宏基因组测序的主流二代测序仪有Illumina MiseqRoche 454,二者基本参数比较见表1,您可以视您的需求而选择测序仪。一般情况下,我们推荐您使用Miseq进行测序。

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生物信息学分析

基于靶向测序的宏基因组学生物信息分析产品介绍见表2

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实验验证

1) 分子学实验验证

用传统的微生物多样性研究手段如T-RFLPPCR-DGGE可以验证群落中出现的优势物种,但只能得到物种的相对丰度排序,不能得到物种的绝对丰度。

2) 克隆文库验证

通过构建16s rDNA克隆文库,借助Sanger测序法,然后通过序列比对确定群落中的物种组成及相对丰度,但该方法受主观因素影响较大。

3) 比较验证

通过与已报道的类似环境微生物组成进行比较,验证我们结果的可靠性。

应用方向

1) 确定biomarkers

确定不同生境或者处理组中差异明显的物种,作为该特殊生境或者处理组的生物标记物。

2) 极端微生物的发现

通过研究极端环境与对照环境中微生物的组成,确定极端环境中的极端微生物,指导极端微生物的提取和纯培养。

3) 病原微生物基因分型

通过16s rDNA进行病原微生物种下水平的基因分型,并确定不同基因分型与疾病的相关性。

 分析结果展示

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多样品OTUs HeatmapNetwork

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群落微生物物种组成柱状图(Genus level)

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微生物群落组成气泡图(Order level

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组与组间多样性指数差异分析图5weighted_unifrac PcoA分析

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相似性聚类及CCA分析

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6  LDALinear Discriminant Analysis)分析

参考文献

[1]   Soumitesh Chakravorty, Danica Helb, Michele Burday, et al. A detailed analysis of 16S ribosomal RNA gene segments for the diagnosis of pathogenic bacteria. Journal of Microbiological Methods, 2007, 69: 330-339.

[2]   Anna Engelbrektson, Victor Kunin, Kelly C Wrighton, et al. Experimental factors affecting PCR-based estimates of microbial species richness and evenness. The International Society for Microbial Ecology Journal, 2010, 4: 642-647.

[3]   Anna Klindworth, Elmar Pruesse,Timmy Schweer, et alEvaluation of general 16S ribosomal RNA gene PCR primers for classical and next-generation sequencing-based diversity studies. Nucleic Acids Research, 2012, doi: 10.1093/nar/gks808.

[4]   Jens Walter, Christian Hertel, Gerald W. Detection of LactobacillusPediococcusLeuconostoc, and Weissella species in human feces by using group-specific PCR primers and denaturing gradient gel electro-phoresis. Applied and Environmental Microbiology, 2001, 67: 2578-2585.

[5]   Lin Liu, Yinhu Li, Siliang Li, et alComparison of next-generation sequencing systems. Journal of Biomedicine and Biotechnology, 2012, doi: 10.1155/2012/251364.

[6]   Michael A Quail, Miriam Smith, Paul Coupland, et al. A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers. BioMed Central Genomics, 2012, 13: 341.

 

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