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 微生物De novo测序技术链条式解决方案

样品要求

1)  生物质样品:4℃低温保存,并尽快进行DNA提取或安排送样。

2)  DNA样品:样品量≥500 ng,样品浓度≥10 ng/μL,样品纯度OD260/OD280 = 1.8 ~ 2.0;样品切忌反复冻融,送样时请

使用冰袋或干冰。

注:DNA提取过程中避免外源DNA的污染。

建库及测序平台

1)  短片段文库,Miseq深度测序,以及初步基因组组装,可以快速完成微生物基因组框架图。

2)  长片段文库和短片段文库,HiseqMiseq深度测序,以及反复优化基因组组装策略,可以得到微生物基因组精细图。

3)  综合利用一代二代甚至三代测序技术,利用多种基因组组装策略,最终得到完整的基因组序列,即微生物基因组完成图。

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生物信息学分析

微生物De novo测序生物信息分析产品介绍见表2

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基因组组装结果评价

1) 基因组覆盖度分析

基于参考序列:由客户提供参考序列,与组装结果进行比对分析,得出两者间的交集区域,进而估算基因组的覆盖度;

基于k-mer分析:根据基因组的k-mer性质,利用k-mer分布的统计规律估算出基因组的大小,与组装出来的基因组大小进行比较,进而估算基因组的覆盖度。

2) 基因区覆盖度分析

首先从参考序列上提取基因序列,根据测序reads与参考序列的比对,来确定用于评价的基因序列(这里取coverage > 50%的基因),然后用组装结果与这些基因序列进行blast比对,

进而估算得到组装结果的基因区覆盖度信息。

3) NR库比对

将组装结果与NR数据库比对,采用严格的过滤条件(如E-value小于1e-5,序列98%的相似度)去除污染,保证结果最大程度的准确性。

基因功能验证

1) 基因敲除

将特定功能的基因敲除掉,验证该基因的在细胞水平的真实功能。

2) 转基因试验

通过转基因手段,将特定功能基因移植到模式生物中,验证该基因功能。

分析结果展示

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图1 CRISPR序列预测结果

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图2 KEGG pathway

注:图中标为紫色的基因表示在此细菌的基因组中发现了该基因

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图3 COG功能注释分类统计图

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图4 比较基因组图谱

注:由内向外分别为:组装得到的Myco菌基因组、GC含量、参考基因组Myco Avium 104、参考基因组Myco Avium K10、参考基因组Myco Avium MAP、正链上的基因、负链上的基因,

与参考基因组序列序列一致性高颜色就深,反之则浅。

参考文献

[1]   Kanehisa M, Goto S, Hattori M, et al. From genomics to chemical genomics: new developments in KEGG. Nucleic Acids Research, 2006, 34(Database issue): D354-7.

[2]   Wolf YI, Makarova KS, Yutin N, et al. Updated clusters of orthologous genes for Archaea: a complex ancestor of the Archaea and the byways of horizontal gene transfer. Biology Direct, 2012, 7: 46.

[3]   NF Alikhan, NK Petty, NL Ben Zakour, et al. BLAST Ring Image Generator (BRIG): simple prokaryote genome comparisons. BioMed Central Genomics, 2011, 12: 402.

[4]   Ruiqiang Li, Hongmei Zhu, Jue Ruan1, et al. De novo assembly of human genomes with massively parallel short read sequencing. Genome Research, 2010, 20: 265-272.

  

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